用qPCR檢測支原體，這3個關鍵點要注意！

更新時間：2023-05-01 | 點擊率：953

實時定量聚合酶鏈式反應（qPCR）是一種高靈敏度、高精確度的分子生物學技術，用于檢測和量化DNA或RNA的數(shù)量。該項技術已經廣泛用于生物相關行業(yè)的檢測項目中，其中就包括支原體檢測。

我們都知道，支原體污染對于細胞相關的臨床項目危害巨大，支原體檢測是項目申報的必要環(huán)節(jié)。實現(xiàn)檢測的高靈敏度、高特異性，并盡可能縮短實驗時間，是非常有意義的。

藥典方法中，培養(yǎng)法和指示細胞法都各有缺點，而qPCR方法兼顧了二者的優(yōu)點，受到眾多從業(yè)人員的青睞。那么在實驗過程中，有哪些注意事項？本期內容，以德國Minerva Biolabs公司生產的Venor Gem qEP為例，盤點qPCR檢測支原體的關鍵點。

Venor Gem qEP試劑盒能檢測多種支原體、靈敏度高、遵循歐洲藥典流程要求。

Part.01 樣品處理

一般來說，該試劑盒適用于細胞、細胞培養(yǎng)上清等物質的支原體檢測。

當細胞長至80%-90%時，收集樣品。此時可對樣品進行95℃的孵育處理。

需要注意的是：細胞培養(yǎng)產物中可能存在PCR抑制物質，例如：細胞顆粒、較大的樣品體積或其他生物材料（疫苗、石蠟包埋樣品等）、胎牛血清含量＞5%等情況，需要在進行PCR之前，對樣品進行DNA提取處理，以盡可能減輕無關因素對實驗結果的干擾。

這里推薦試用配套的德國MB支原體提取試劑盒：

有小伙伴可能會產生疑問：培養(yǎng)基中的青霉素或者鏈霉素，會不會對實驗結果產生影響？

就目前有記錄的研究結果而言，沒有發(fā)現(xiàn)常用的“雙抗"會對檢測的靈敏度等造成影響。

Part.02 反應體系建立

在進行支原體qPCR檢測時，需要設置合適的反應體系和條件。反應體系包括Mix、樣品DNA、緩沖液、內控等組分。反應條件包括擴增溫度、時間、周期數(shù)和熒光信號閾值等參數(shù)。

需要注意的是：需嚴格按照使用說明中的參數(shù)進行設置。隨意更改數(shù)值可能會影響檢測結果的準確性。

Part.03 結果解釋

FAM通道：檢測支原體熒光信號。

HEX通道：檢測內控對照熒光信號。

需要注意的是：支原體DNA和內控DNA存在信號的競爭性抑制。支原體DNA越多，F(xiàn)AM通道信號越高，檢測內控對照的HEX通道信號越低。

定量需基于Ct值和DNA標準曲線。

Ct＜40為陽性結果。Ct≥40為陰性結果。