15分鐘出結(jié)果！支原體快檢試劑盒使用全指南（含避坑要點(diǎn)）?  

支原體污染是細(xì)胞培養(yǎng)中的“隱形殺手”，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、功能異常，甚至實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)無(wú)效。支原體快檢試劑盒憑借“快速（10-15分鐘）、靈敏（檢測(cè)限≤10CFU/mL）、操作簡(jiǎn)便”的優(yōu)勢(shì)，成為科研實(shí)驗(yàn)室日常質(zhì)控的核心工具。為確保檢測(cè)結(jié)果精準(zhǔn)，需嚴(yán)格遵循以下使用須知：?  

一、檢測(cè)前：做好3項(xiàng)核心準(zhǔn)備（避免基礎(chǔ)失誤）?  

1.樣本準(zhǔn)備：選對(duì)樣本類型，確保濃度適配?  

適用樣本：僅用于“細(xì)胞培養(yǎng)上清液”“細(xì)胞裂解液”或“病毒收獲液”，不適用全血、組織勻漿等復(fù)雜樣本（復(fù)雜樣本中的蛋白、雜質(zhì)會(huì)干擾檢測(cè)反應(yīng)）；?  

樣本要求：?  

細(xì)胞上清液：需收集“對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞的上清”（細(xì)胞匯合度70%-80%，避免細(xì)胞凋亡釋放的核酸污染），無(wú)需離心（輕微沉淀不影響檢測(cè)，劇烈離心可能丟失支原體）；?  

樣本濃度：若細(xì)胞密度過(guò)低（＜1×10?cells/mL），需先將上清液“5000rpm離心10分鐘”，取沉淀用試劑盒配套的“樣本稀釋液”重懸（提升支原體濃度，避免假陰性）；?  

禁忌：樣本不可用“含抗生素的培養(yǎng)基”（如青霉素、鏈霉素會(huì)抑制支原體活性，導(dǎo)致檢測(cè)信號(hào)減弱），若培養(yǎng)基含抗生素，需更換無(wú)抗培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后再取樣。?  

2.試劑準(zhǔn)備：檢查狀態(tài)，平衡溫度?  

試劑完整性：打開(kāi)試劑盒后，確認(rèn)“檢測(cè)卡（含反應(yīng)區(qū)）、樣本稀釋液、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照”4類試劑齊全，且無(wú)漏液、變質(zhì)（如檢測(cè)卡反應(yīng)區(qū)變色、稀釋液渾濁，需立即更換）；?  

溫度平衡：所有試劑需從2-8℃冰箱取出后，在“室溫（20-25℃）放置15分鐘”再使用（低溫試劑會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)速率變慢，延長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)間，甚至出現(xiàn)假陰性）；?  

避免污染：陽(yáng)性對(duì)照需單獨(dú)存放（用醒目標(biāo)簽標(biāo)注），取用時(shí)使用專用移液器吸頭，避免交叉污染樣本或陰性對(duì)照（否則會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性）。?  

3.環(huán)境與工具準(zhǔn)備：控制干擾因素?  

環(huán)境要求：在“無(wú)風(fēng)、潔凈的超凈臺(tái)或?qū)嶒?yàn)臺(tái)”操作，避免陽(yáng)光直射（試劑盒中的熒光探針對(duì)強(qiáng)光敏感，直射會(huì)導(dǎo)致熒光淬滅，影響結(jié)果判讀）；?  

工具適配：需準(zhǔn)備“100μL微量移液器（精度±2%）”“無(wú)菌離心管”“一次性手套”，移液器需提前校準(zhǔn)（避免移液體積偏差導(dǎo)致檢測(cè)誤差），手套需全程佩戴（防止手部皮膚脫落的細(xì)胞、核酸污染樣本）。?  

二、檢測(cè)中：嚴(yán)格遵循4步操作流程（每步都有關(guān)鍵細(xì)節(jié)）?  

步驟1：樣本處理（僅需2分鐘，核心是“均勻混合”）?  

取“100μL待檢測(cè)樣本”加入到“樣本稀釋管”中，用移液器反復(fù)吹吸5次（確保樣本與稀釋液充分混合，避免局部濃度不均）；?  

若樣本為“細(xì)胞裂解液”，需先加入試劑盒配套的“蛋白酶K”（10μL/管），37℃孵育5分鐘（降解細(xì)胞蛋白，釋放支原體核酸，提升檢測(cè)靈敏度），再加入稀釋液。?  

步驟2：加樣反應(yīng)（關(guān)鍵是“加樣量準(zhǔn)確，避免溢出”）?  

用移液器吸取“50μL處理后的樣本”，垂直滴加至檢測(cè)卡的“加樣孔”中（不可滴加在反應(yīng)區(qū)，加樣量需精準(zhǔn)，過(guò)多會(huì)導(dǎo)致液體溢出污染反應(yīng)線，過(guò)少會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)不充分）；?  

加樣后立即計(jì)時(shí)，室溫靜置10-15分鐘（不可超過(guò)20分鐘，超時(shí)會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)線擴(kuò)散，無(wú)法判讀結(jié)果），期間不可晃動(dòng)檢測(cè)卡（晃動(dòng)會(huì)破壞反應(yīng)區(qū)的層析過(guò)程）。?  

步驟3：陽(yáng)性/陰性對(duì)照同步檢測(cè)（必須做，排除試劑盒問(wèn)題）?  

陽(yáng)性對(duì)照：取“100μL陽(yáng)性對(duì)照液”，按“步驟1-2”同步操作（若陽(yáng)性對(duì)照無(wú)檢測(cè)線，說(shuō)明試劑盒失效，需更換新試劑盒）；?  

陰性對(duì)照：取“100μL陰性對(duì)照液”（通常為無(wú)支原體的細(xì)胞培養(yǎng)基），同步操作（若陰性對(duì)照出現(xiàn)檢測(cè)線，說(shuō)明存在交叉污染，需重新取樣檢測(cè)）。?  

步驟4：結(jié)果判讀（15分鐘準(zhǔn)時(shí)判讀，超過(guò)時(shí)間無(wú)效）?  

判讀標(biāo)準(zhǔn)：檢測(cè)卡含“質(zhì)控線（C線）”和“檢測(cè)線（T線）”，僅C線顯色為陰性（樣本無(wú)支原體污染），C線+T線均顯色為陽(yáng)性（樣本含支原體），無(wú)C線顯色為無(wú)效（需重新檢測(cè)）；?  

特殊情況：若T線顯色“微弱但可見(jiàn)”（需在白色背景下觀察），判定為“弱陽(yáng)性”（提示支原體低濃度污染，建議3天后重新取樣檢測(cè)，或更換高靈敏度試劑盒確認(rèn)）。?  

三、檢測(cè)后：做好3項(xiàng)收尾工作（保障后續(xù)實(shí)驗(yàn)與安全）?  

1.結(jié)果記錄：詳細(xì)標(biāo)注，便于追溯?  

記錄內(nèi)容：需填寫“檢測(cè)日期、樣本名稱（如HeLa細(xì)胞第5代上清）、檢測(cè)時(shí)間、結(jié)果（陰性/陽(yáng)性/弱陽(yáng)性）、操作人員”，若為陽(yáng)性，需補(bǔ)充“細(xì)胞培養(yǎng)條件（如培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)溫度）”，便于分析污染來(lái)源；?  

保存方式：檢測(cè)卡需用密封袋封裝后，與記錄單一起存放（2-8℃可保存7天，用于后續(xù)復(fù)查或比對(duì)）。?  

2.試劑處理：分類丟棄，避免污染?  

廢棄試劑：陽(yáng)性對(duì)照、樣本稀釋管、移液器吸頭需放入“生物安全垃圾袋”，高溫滅菌（121℃，30分鐘）后丟棄（支原體有傳染性，避免環(huán)境擴(kuò)散）；?  

剩余試劑：未用完的檢測(cè)卡需放回原試劑盒，密封后2-8℃保存（避免反復(fù)凍融，保質(zhì)期內(nèi)使用，過(guò)期試劑不可再用）。?  

3.環(huán)境清潔：消除殘留，防止交叉污染?  

實(shí)驗(yàn)臺(tái)面：用“75%乙醇擦拭”（支原體對(duì)乙醇敏感，可有效殺滅），超凈臺(tái)需開(kāi)啟紫外燈照射30分鐘（消毒臺(tái)面和空氣）；?  

移液器：若操作中不慎污染，需用“移液器專用消毒濕巾”擦拭槍頭推桿和吸頭座，避免后續(xù)樣本污染。?  

四、避坑指南：5個(gè)常見(jiàn)錯(cuò)誤及解決辦法?  

假陰性：樣本中支原體濃度過(guò)低?  

錯(cuò)誤原因：未離心濃縮樣本，或樣本取自“靜止期細(xì)胞”（支原體主要存在于對(duì)數(shù)期細(xì)胞上清）；?  

解決：下次取樣前，將細(xì)胞傳代至對(duì)數(shù)期（匯合度70%），上清液5000rpm離心10分鐘后檢測(cè)。?  

假陽(yáng)性：操作中交叉污染?  

錯(cuò)誤原因：陽(yáng)性對(duì)照與樣本共用移液器吸頭，或檢測(cè)卡加樣后被陽(yáng)性樣本污染；?  

解決：陽(yáng)性對(duì)照需單獨(dú)使用一套移液器和吸頭，加樣后立即蓋上檢測(cè)卡蓋子，避免液體飛濺。?  

無(wú)效結(jié)果：加樣量不足或檢測(cè)卡過(guò)期?  

錯(cuò)誤原因：加樣量＜50μL（反應(yīng)不充分），或檢測(cè)卡超過(guò)保質(zhì)期（試劑活性下降）；?  

解決：嚴(yán)格按說(shuō)明書控制加樣量，使用前核對(duì)試劑盒保質(zhì)期（通常為12個(gè)月，開(kāi)封后3個(gè)月內(nèi)用完）。?  

結(jié)果誤判：超時(shí)觀察或強(qiáng)光下判讀?  

錯(cuò)誤原因：超過(guò)20分鐘判讀（T線擴(kuò)散消失），或在陽(yáng)光直射下觀察（熒光信號(hào)被掩蓋）；?  

解決：15分鐘準(zhǔn)時(shí)判讀，在白色背景燈或自然光下觀察（避免強(qiáng)光）。?  

試劑變質(zhì)：未平衡溫度直接使用?  

錯(cuò)誤原因：低溫試劑直接加樣，導(dǎo)致反應(yīng)區(qū)層析受阻；?  

解決：試劑需室溫平衡15分鐘，觸摸試劑管外壁無(wú)冰涼感后再使用。?  

五、適用范圍與局限性：明確使用邊界?  

適用場(chǎng)景：僅用于“科研實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)的支原體質(zhì)控”，不用于臨床診斷（如人體支原體檢測(cè)）；?  

不適用情況：樣本含“高濃度蛋白（如血清濃度＞20%）”“強(qiáng)還原劑（如β-巰基乙醇）”時(shí)，會(huì)抑制檢測(cè)反應(yīng)，需先用“蛋白去除試劑盒”預(yù)處理樣本后再檢測(cè)。?